大豆（甘氨酸更大（L.）Merr.）是重要的作物植物之一，是油和蛋白質(zhì)的主要來源，但產(chǎn)量受到大豆囊腫線蟲（SCN，Heterodera甘氨酸）的限制，它寄生在大豆根上。挽救SCN造成的產(chǎn)量損失的主要手段是遺傳抗性[1]。大多數(shù)商業(yè)抗性品種的抗性來自北京和PI88788，但正在逐漸被SCN克服[2]。
近年來，rhg1和Rhg4的功能分析取得了巨大的成功[3]。它們中的四個抗性基因已經(jīng)逐漸得到驗證，包括GmAAT ，GmSNAP18 ，GmWI12 和GmSHMT08 。在這些基因中發(fā)現(xiàn)了兩種類型的抗性表型，北京型和PI88788型[2]。北京型對SCN種族3[8，9]產(chǎn)生快速的抗性反應(yīng)，而PI88788型導(dǎo)致合胞體緩慢變性[10]。這兩種耐藥性類型都導(dǎo)致SCN幼體的發(fā)育停滯，這已被酸性紫紅色染色觀察到[11]。耐藥基因通常抑制SCN的發(fā)展，但感染過程不受抑制。這些結(jié)果鼓勵了對抗性候選基因的研究，例如含有亮氨酸的富亮氨酸區(qū)域（LRR）蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)激酶[12]，細胞色素P450s和次級代謝途徑中的酶。
大豆轉(zhuǎn)化在基因功能研究中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，但大豆的穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化通常需要四到六個月才能收獲轉(zhuǎn)基因植物。因此，有必要開發(fā)一種的基因表達系統(tǒng)來研究抗性基因。
與遺傳轉(zhuǎn)化相比，根瘤菌介導(dǎo)的根系突變體（根瘤菌）介導(dǎo)的毛根轉(zhuǎn)化更快，轉(zhuǎn)化頻率更高[18]。A. 根瘤菌以類似于根瘤菌引起的冠膽的方式引起大豆的毛茸茸的根部。兩者都在傷口部位感染，并將T-DNA從細菌轉(zhuǎn)移到大豆細胞。最初，毛發(fā)根系是從根瘤菌菌株K599的子葉外植體中誘導(dǎo)的。綜合豆科研究小組（IGRS，澳大利亞）提供了一個修改后的方案，允許毛根從子葉節(jié)點和下胚軸再生[18]。由于大豆根系中的SCN寄生蟲，驗證毛根中靶基因?qū)CN的抗性很方便。
這些案例和方法加速了大豆根系生物學的研究，但使用根瘤菌介導(dǎo)的毛根轉(zhuǎn)化研究大豆與SCN相互作用存在三個缺點。首先是通過PCR或Sanger測序鑒定陽性外來根的繁瑣過程，這是直接但效率低下的。其中一種解決方案是使用花青素作為標記，這已被應(yīng)用于根結(jié)節(jié)的研究[21]。然而，花青素屬于黃酮類化合物，由于花青素的抗性潛力，可能不適合研究大豆和甘氨酸之間的相互作用。GFP被認為是大豆轉(zhuǎn)基因選擇中的熒光標記[24]。第二個缺點是大多數(shù)操作需要無菌環(huán)境，這嚴重影響了效率，盡管這可以通過在農(nóng)桿菌感染部位使用下胚軸來解決。最后一個缺點是H. 甘氨酸的第二階段幼體（J2s，感染階段）需要在接種前進行絕育。這種操作降低了線蟲的生命力。
在這里，我們報告了快速，可見和有效的熒光毛茸茸根與SCN（FHR-SCN）病理系統(tǒng)，用于驗證大豆候選基因的抗性表型。FHR-SCN病理系統(tǒng)基于根瘤菌介導(dǎo)的大豆下胚層轉(zhuǎn)化，但不依賴于無菌操作;也無需制備共培養(yǎng)基和根系誘導(dǎo)培養(yǎng)基或?qū)CN幼體進行滅菌。陽性根可以在視覺上選擇并用SCN接種。使用這種方法，只需6周即可驗證候選基因的表型。此外，我們構(gòu)建了一種新型質(zhì)粒pNI-GmUbi，用于過表達實驗。此外，抗性表型基因間歇性錳親-1用FHR-SCN方法從轉(zhuǎn)基因大豆植物中復(fù)制。結(jié)果表明，兩種方法差異不大。
總之，F(xiàn)HR-SCN病理系統(tǒng)大大減少了驗證對SCN的耐藥表型的時間。我們預(yù)計病理系統(tǒng)將廣泛應(yīng)用于大豆與SCN之間相互作用的分析。
上圖為使用LUYOR-3415RG激發(fā)光源照射觀察的效果
Figure 2. Root system regenerated from the wound of explant. (a) Root system observed by a bright-field where the adventitious roots and positive hairy roots cannot be separated by sight; (b) root system observed by a 495 nm bind pass filter where the adventitious roots and fluorescent hairy roots can be easily distinguished with LUYOR-3415RG used as the excitation light source.
